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Pseudomonas spp. figura entre os principais psicrotróficos contaminantes do leite cru refrigerado. Psicrotróficos são microrganismos que se desenvolvem a 7°C ou menos, podendo crescer em alimentos refrigerados (Carminati et al., 2019). O gênero Pseudomonas spp. pertence à família Pseudomonadaceae e reúne mais de 259 espécies de bactérias gram-negativas, aeróbias, não fermentadoras de carboidratos, não esporuladas e que apresentam motilidade (Girard et al., 2021).
Embora Pseudomonas spp. sejam eliminadas pelos tratamentos térmicos aplicados ao leite cru, as enzimas proteolíticas e lipolíticas secretadas por essas bactérias podem resistir ao calor e permanecer ativas, degradando lipídeos e proteínas, sendo responsáveis por diversos defeitos em produtos lácteos, como o surgimento de sabores rançosos, amargos, gelatinização do leite UHT e baixo rendimento na produção de queijos (Machado et al., 2017; Marchand et al., 2009; Zhang et al., 2019).
Além disso, algumas espécies de Pseudomonas também podem produzir pigmentos fluorescentes ou coloridos em queijos (Carminati et al., 2019; Palleroni, 2015) (Figura 1). Pseudomonas presentes no ambiente também podem ser patogênicas ao homem, como P. aeruginosa, que pode apresentar multirresistência a antibióticos e causar infecções de difícil tratamento, especialmente em indivíduos imunocomprometidos (Engelhart et al., 2002).
Figura 1. Defeitos causados por Pseudomonas spp. em lácteos. Fonte dos ícones - Flaticon (Free Icons and Stickers) - (Freepik, 2022).
A maioria das espécies de Pseudomonas spp. são encontradas naturalmente no solo, na água, em alimentos de origem vegetal e animal, onde participam de processos de decomposição e biodegradação, desempenhando papel fundamental no equilíbrio natural dos ecossistemas (Hossain, 2014; Palleroni, 2015).
Devido à natureza ubíqua dessas bactérias, a contaminação do leite pode ocorrer a partir do ambiente durante a ordenha e o armazenamento, realizados em condições inadequadas de higiene, bem como, em diferentes etapas do processamento do leite e de seus derivados, especialmente por recontaminações após a pasteurização (Figura 2). P. fluorescens, P. putida, P. fragi e P. lundensis são as principais espécies deteriorantes de lácteos (Carminati et al., 2019; Liao, 2006; Narvhus et al., 2021; Rossi et al., 2017).
Figura 2. Fontes de contaminação de leite e derivados por Pseudomonas spp. Fonte dos ícones - Flaticon (Free Icons and Stickers) - (Freepik, 2022).
Pseudomonas spp. são capazes de formar biofilmes em diferentes tipos de superfície, o que aliado à sua diversidade genética e metabólica favorecem a sua persistência como deteriorante de leite e derivados. Um biofilme é uma comunidade de microrganismos firmemente aderidos a uma superfície, fixados e encapsulados por uma matriz porosa com múltiplas camadas, composta por diversas substâncias poliméricas extracelulares (EPS) que incluem polissacarídeos, proteínas, enzimas, ácidos nucleicos e lipídios, continuamente secretadas pelas células presentes na matriz do biofilme (Figura 3) (Bai; Rai, 2011; Reichler et al., 2018).
O biofilme serve como estrutura de proteção estratégica para as bactérias que o compõem, conferindo diversas vantagens competitivas aos microrganismos, contribuindo para elevar sua resistência à desinfecção das superfícies, aumentando sua capacidade de adaptação, de colonização e sua permanência nos ambientes (Bai; Rai, 2011; Reichler et al., 2018).
Pseudomonas spp. já foram encontradas colonizando e formando biofilmes em ordenhadeiras, tubulações de água (Nucera et al., 2016), tubulações de aço inoxidável, pasteurizadores (Cleto et al., 2012; Zou; Liu, 2018), tanques de expansão, tanques de queijo, utensílios de corte de coalhada (Ipek; Zorba, 2018), membranas de osmose reversa (Anand; Singh, 2013), envasadoras (Reichler et al., 2018), paredes, maçanetas, chão e ralos das áreas de produção (Castro et al., 2021).
Figura 3. Formação de biofilmes: Na fase 1 ocorre a adesão fraca entre as bactérias e a superfície. Nas fases 2 e 3 ocorrem a adesão irreversível na superfície, com a multiplicação celular e a produção de exopolissacarídeos e demais compostos da matriz do biofilme. Na fase 4 ocorre o crescimento e a maturação do biofilme. Na fase 5 ocorre a difusão de células colonizadoras a partir do desprendimento de pedaços do biofilme maduro. Essas células colonizam novas superfícies, iniciando um novo ciclo de colonização.
Os biofilmes formados por Pseudomonas spp. são um desafio para a cadeia produtiva do leite, sendo uma fonte contínua de contaminação microbiana que se estabelece em curtos intervalos de tempo após o contato das bactérias com vários tipos de superfícies, como aço inoxidável (Castro et al., 2021), plástico e borracha (Mosteller; Bishop, 1993).
Quando encapsuladas em biofilmes, Pseudomonas spp. são capazes de se proteger contra a ação dos sanitizantes comumente empregados na higienização das linhas de processamento de alimentos, contribuindo para reduzir a eficácia da sanitização e a vida útil de utensílios e equipamentos, além de garantir a persistência e a disseminação de microrganismos contaminantes nesses ambientes (Cleto et al., 2012; Reichler et al., 2018; Rossi et al., 2017).
Estudos anteriores sugerem que as concentrações de uso recomendadas por muitos fabricantes de sanitizantes à base de hipoclorito de sódio (Pagedar; Singh, 2015) ou de peróxido de hidrogênio (Cochran; Mcfeters; Stewart, 2000) sejam insuficientes para eliminar biofilmes. Esse fenômeno se deve ao fato de que as células, quando em biofilme, são capazes de ativar um conjunto de mecanismos de evasão à ação dos sanitizantes e ao aumento da “blindagem” do biofilme à penetração dos ativos bactericidas contidos nos produtos de limpeza.
Por exemplo, biofilmes de Pseudomonas spp. frequentemente expostos ao cloro livre apresentaram expressão aumentada de bombas de efluxo que removem o cloro de dentro das células, impedindo que ele exerça seu efeito biocida (Da Cruz Nizer; Inkovskiy; Overhage, 2020; Hou et al., 2019; Tong et al., 2021).
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A forma predominante de disseminação e de resistência bacteriana em plantas de processamento de alimentos é por meio da liberação periódica de fragmentos dos biofilmes maduros, que se fixam nas superfícies ao redor, formando novos biofilmes normalmente compostos por múltiplas espécies, que estabelecem relações de colaboração e am a apresentar mais resistência e sobrevida quando em conjunto do que nos biofilmes compostos por uma única espécie (Simões; Simões; Vieira, 2009).
Foram relatadas a ocorrência de biofilmes formados entre espécies de Pseudomonas, Listeria, Acinetobacter, Serratia, Klebsiella, Alcaligenes e Staphylococcus em silos, tanques, borrachas, pasteurizadores, trocadores de calor, linhas de pasteurização e em injetores de vapor (Mosteller; Bishop, 1993; Yuan et al., 2019).
A exposição de biofilmes de Pseudomonas spp. a situações de estresse, comumente encontradas no ambiente de processamento de alimentos, como a baixa disponibilidade de nutrientes e a exposição frequente a concentrações subletais de agentes biocidas, contribui para aumentar a atividade deteriorante dessas bactérias sobre os alimentos por meio do aumento da produção das enzimas hidrolíticas, necessárias para aumentar a concentração de nutrientes disponíveis para as camadas mais profundas dos biofilmes (Hemati et al., 2016, 2020).
Vale lembrar que a produção de enzimas hidrolíticas por Pseudomonas varia de acordo com a espécie e em função das condições de crescimento, temperatura e estação do ano (Meng et al., 2017). Estudos anteriores sugerem que Pseudomonas spp. isoladas do leite cru no período de inverno produzem enzimas com maior atividade enzimática e potencial deteriorante do que as isoladas no período de verão (Marchand et al., 2009).
Os biofilmes não são removidos facilmente pelos procedimentos de limpeza de rotina. No segmento alimentício, o design sanitário dos equipamentos tem um papel de extrema relevância na eficácia dos procedimentos de limpeza Cleaning In Place (CIP), sendo importante selecionar equipamentos livres de soldas mal polidas, pontos de ferrugem ou pontos que não sejam limpos completamente pelos dispositivos de limpeza CIP instalados.
Além do design higiênico dos equipamentos, a limpeza das superfícies de uso geral e o treinamento dos colaboradores quanto à aplicação de Boas Práticas de Fabricação e ao uso correto dos produtos de limpeza também são ferramentas importantes no combate à formação de biofilmes.
O processo de limpeza CIP muitas vezes se mostra ineficaz na remoção dos biofilmes por não contemplar os tempos de contato, as ações mecânicas e as concentrações de sanitizantes adequados para eliminação dos biofilmes (Zou; Liu, 2018). Os procedimentos de limpeza manual (COP ou Cleaning Out Place), muito empregados na limpeza de utensílios utilizados no processamento de alimentos, frequentemente não são capazes de remover os biofilmes aderidos às superfícies (Ipek; Zorba, 2018).
É indispensável que as indústrias de laticínios adotem programas de limpezas preventivas validados para remoção dos biofilmes e das incrustrações minerais e orgânicas derivados do processamento de lácteos.
Várias estratégias têm sido propostas para controle de biofilmes na indústria de alimentos, as quais incluem a utilização de superfícies tratadas com anti-aderentes; revestimentos antimicrobianos; agentes biológicos (bacteriófagos),tratamentos físicos (luz uv e ultrassom) e químicos (sanitizantes e antimicrobianos naturais); degradação da matriz do biofilme e dispersão das células na etapa de higienização; inibição da regulação gênica do biofilme; e interferência no Quorum sensing das bactérias (Galié et al., 2018).
Entretanto, o problema ainda permanece sem uma solução definitiva, provavelmente devido à complexidade das estruturas do biofilme, que contêm células em estados fisiológicos diferentes e substâncias extracelulares, dificultando a ação das estratégias propostas (Gutiérrez et al., 2016).
Agradecimento
Os autores agradecem a Flaticon[ (Free Icons and Stickers) pelo fornecimento dos Icons usados na elaboração das Figuras 1 e 2.
Referências
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